Sau khi hoàn thành việc phân tách và nuôi cấy nguyên bào sợi có nguồn gốc từ mô ung thư thực quản ở người, các tế bào cần được xác định thêm và phân tích chức năng để đảm bảo các đặc tính sinh học của chúng phù hợp với yêu cầu thí nghiệm. Sau đây là các bước hoạt động chính tiếp theo:

1. Quan sát hình thái tế bào

- Thường xuyên quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược. Các nguyên bào sợi nguyên thủy thường có hình thoi hoặc đa giác, phát triển trên các bức tường và kéo dài tế bào chất tốt. Nếu xuất hiện các tế bào trôi tròn hoặc tụ tập bất thường, có thể là dấu hiệu ô nhiễm hoặc tình trạng tế bào kém, cần đánh giá lại điều kiện nuôi cấy.

2. Nhận dạng huỳnh quang miễn dịch

- nhuộm huỳnh quang miễn dịch bằng các dấu hiệu cụ thể như Vimentin, alpha-SMA. Nguyên bào sợi nên biểu hiện Vimentin cao, trong khi tỷ lệ alpha-SMA dương tính có thể phản ánh mức độ kích hoạt của nó. Lưu ý thiết lập đối chiếu đồng loại để loại trừ các kết hợp không đặc biệt.

3. Thử nghiệm xác minh chức năng

- Phát hiện khả năng tăng sinh: Sử dụng phương pháp CCK-8 hoặc EdU để đánh giá hoạt động tăng sinh của tế bào, so sánh sự khác biệt giữa nguyên bào sợi cận ung thư và nguyên bào sợi có nguồn gốc ung thư.

Phân tích bài tiết collagen: Mức độ bài tiết collagen loại I/III được phát hiện bằng ELISA hoặc Western Blot để xác định rõ khả năng gây xơ hóa của nó.

Thí nghiệm đồng nuôi cấy: Nguyên bào sợi được nuôi cấy cùng với các dòng tế bào ung thư thực quản như KYSE-150 để quan sát ảnh hưởng của chúng đối với sự di cư xâm lấn của tế bào ung thư (ví dụ: thí nghiệm Transwell).

4. Bảo quản lạnh và phục hồi

- Chọn các tế bào giai đoạn tăng trưởng logarit, đóng gói trong các ống lưu trữ đông lạnh với 10% DMSO, chuyển sang nitơ lỏng sau khi làm mát theo thủ tục. Bồn tắm nước nhanh tan chảy khi hồi sức, ly tâm loại bỏ chất lỏng đông lạnh, treo lại trong môi trường huyết thanh nồng độ cao và thay đổi chất lỏng sau 24 giờ.

Lưu ý

- Hoạt động vô trùng nghiêm ngặt để tránh ô nhiễm Mycoplasma;

- Số lượng tế bào gốc được khuyến nghị không quá 5 thế hệ trong trường hợp trôi kiểu hình;

- Thử nghiệm chức năng cần được lặp lại nhiều hơn 3 lần để đảm bảo độ tin cậy của dữ liệu.