Nguyên tắc của ELISA

ELISA dựa trên pha rắn của kháng nguyên hoặc kháng thể và đánh dấu enzyme của kháng nguyên hoặc kháng thể. Các kháng nguyên hoặc kháng thể gắn trên bề mặt của các vectơ pha rắn vẫn duy trì hoạt động miễn dịch của chúng và các kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bởi enzyme giữ lại cả hoạt động miễn dịch của chúng và hoạt động của enzyme. Tại thời điểm xác định, mẫu vật được kiểm tra (xác định kháng thể hoặc kháng nguyên trong đó) phản ứng với kháng nguyên hoặc kháng thể trên bề mặt của chất mang pha rắn. Các phức hợp kháng nguyên kháng thể hình thành trên chất mang pha rắn được tách ra khỏi các chất khác trong chất lỏng bằng phương pháp rửa. Các kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bởi enzyme được thêm vào, cũng được liên kết với các vectơ pha rắn bằng phản ứng. Lượng enzyme trên pha rắn tại thời điểm này có tỷ lệ nhất định với lượng chất được kiểm tra trong mẫu vật. Sau khi thêm chất nền của phản ứng enzyme, chất nền được xúc tác bởi enzyme để trở thành sản phẩm màu, lượng sản phẩm có liên quan trực tiếp đến lượng chất được kiểm tra trong mẫu vật, do đó có thể được phân tích định tính hoặc định lượng theo độ sâu của màu sắc. Do hiệu quả xúc tác cao của enzyme, kết quả của phản ứng miễn dịch được khuếch đại gián tiếp, cho phép phương pháp xác định đạt độ nhạy cao.

Loại ELISA

ELISA có thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc để xác định kháng thể. Trong phương pháp xác định này có ba tác nhân cần thiết: (1) tiền kháng khuẩn pha rắn hoặc kháng thể, cụ thể là'chất hấp phụ miễn dịch'(immunosorbent); (2) Kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu bởi enzyme, được gọi là'conjugate'; c) Chất nền của phản ứng enzym. Tùy thuộc vào nguồn gốc và tình trạng của mẫu vật và các điều kiện cụ thể của thử nghiệm, nhiều loại thử nghiệm khác nhau có thể được thiết kế. ELISA được sử dụng trong thử nghiệm lâm sàng chủ yếu có các loại sau:

1. Đo kháng nguyên bằng phương pháp kẹp đôi kháng thể

Phương pháp kẹp đôi kháng thể là phương pháp thường được sử dụng để phát hiện kháng nguyên zui, các bước hoạt động như sau:

1) Liên kết kháng thể đặc hiệu với chất mang pha rắn để tạo thành kháng thể pha rắn. Tẩy rửa loại bỏ các kháng thể và tạp chất không liên kết.

(2) Thêm mẫu vật được kiểm tra, phản ứng giữ ấm. Kháng nguyên trong mẫu vật liên kết với kháng thể pha rắn để tạo thành phức hợp kháng nguyên pha rắn. Rửa loại bỏ các chất không liên kết khác.

3) kháng thể enzyme, phản ứng giữ ấm. Các kháng nguyên trên phức hợp miễn dịch pha rắn liên kết với các kháng thể nhãn enzyme. * Rửa các kháng thể nhãn enzyme không liên kết. Lượng enzyme mang trên chất mang pha rắn tại thời điểm này có liên quan đến lượng kháng nguyên được kiểm tra trong mẫu vật.

(4) Thêm màu nền. Chất nền xúc tác enzyme trên pha rắn trở thành sản phẩm màu. Thông qua so màu, đo lường lượng kháng nguyên trong mẫu vật.

Trong thử nghiệm lâm sàng, phương pháp này được áp dụng để kiểm tra các kháng nguyên phân tử lớn như HBsAg, HBeAg, AFP, hCG, v.v. Bất cứ khi nào có được kháng thể dị tính chống lại kháng nguyên được kiểm tra, phương pháp này có thể được thiết lập để bao bọc các vectơ pha rắn và chuẩn bị các liên kết enzyme. Ví dụ như nguồn gốc của kháng thể là kháng huyết thanh, kháng thể dùng để bọc và dán nhãn enzym lần lượt lấy từ động vật thuộc các giống khác nhau. Ví dụ như áp dụng kháng thể đơn dòng, thông thường chọn hai đơn kháng nhằm vào các cụm quyết định khác nhau trên kháng nguyên, lần lượt dùng để đóng gói chất mang pha rắn và chuẩn bị chất kết hợp enzyme. Phương pháp kẹp tim hai vị trí này có tính đặc hiệu rất cao, hơn nữa có thể đem mẫu vật bị kiểm tra và kháng thể enzym cùng nhau giữ ấm phản ứng, làm một bước kiểm tra. Trong một bước xác định, khi mức độ cao của kháng nguyên được kiểm tra trong mẫu vật, kháng nguyên dư thừa liên kết với kháng thể pha rắn và kháng thể enzyme tương ứng, mà không còn hình thành "phức hợp sandwich". Tương tự như hiện tượng vành đai phía sau của sự dư thừa kháng nguyên trong phản ứng kết tủa, tại thời điểm này giá trị hấp thụ ánh sáng của sự xuất hiện màu sau phản ứng (nằm trên vành đai dư thừa kháng nguyên) giống như giá trị hấp thụ ánh sáng của một nồng độ kháng nguyên nhất định của đường cong tiêu chuẩn (nằm trên vành đai dư thừa kháng thể), chẳng hạn như đo lường theo phương pháp thông thường, kết quả thu được sẽ thấp hơn hàm lượng thực tế, hiện tượng này được gọi là hiệu ứng móc (hookeffect), bởi vì đường cong tiêu chuẩn sau khi đạt đến đỉnh điểm có hình móc. Khi hiệu ứng móc câu nghiêm trọng, phản ứng thậm chí có thể không hiện màu mà xuất hiện kết quả âm tính giả. Do đó, khi sử dụng thuốc thử một bước để xác định các chất có thể tăng bất thường trong mẫu vật (ví dụ HBsAg, AFP và hCG nước tiểu trong huyết thanh, v.v.), cần chú ý đến giá trị zui cao trong phạm vi có thể đo được. Điều chế các tác nhân như vậy với các kháng thể đơn dòng có ái lực cao làm suy yếu hiệu ứng móc. Giả sử có nhiều cụm quyết định giống nhau ở các vị trí khác nhau của phân tử đang được thử nghiệm, chẳng hạn như cụm quyết định A của HBsAg, cũng có thể bao gồm các hợp chất enzyme rắn và chuẩn bị cùng một muab cho quyết định này. Tuy nhiên, trong việc phát hiện HBsAg nên chú ý đến vấn đề phân nhóm, HBs Ag có adr, adw, ayr, ayw4 phân nhóm, mặc dù mỗi phân nhóm có cùng một nhóm A quyết định phản ứng, đây cũng là vấn đề cần chú ý với phương pháp kẹp đơn kháng. Một lưu ý khác cho các kháng nguyên đo bằng phương pháp kẹp lưỡng kháng thể là sự can thiệp của yếu tố thấp khớp (RF). RF là một tự kháng thể, chủ yếu là loại IgM, liên kết với phân đoạn Fc của IgG ở nhiều động vật. Trong các mẫu huyết thanh được sử dụng làm xét nghiệm kẹp lưỡng kháng thể có chứa R F, nó có thể hoạt động như một thành phần kháng nguyên, đồng thời liên kết với kháng thể pha rắn và kháng thể enzyme, cho thấy phản ứng dương tính giả. Phân đoạn F (ab') hoặc Fab được sử dụng làm thuốc thử cho các liên kết enzyme, loại bỏ sự can thiệp của RF do loại bỏ phân đoạn Fc. Liệu thuốc thử ELISA có bị ảnh hưởng bởi RF hay không đã được liệt kê như một chỉ số đánh giá cho loại thuốc thử này. Phương pháp kẹp hai kháng thể thích hợp để xác định kháng nguyên phân tử lớn hơn giá hai hoặc giá hai, nhưng không thích hợp để xác định kháng nguyên bán kháng nguyên và kháng nguyên đơn trị phân tử nhỏ, vì nó không thể hình thành hai vị trí kẹp.

2. Kháng thể được đo bằng phương pháp kẹp đôi kháng nguyên

Mô hình phản ứng tương tự như phương pháp sandwich lưỡng kháng thể. Các liên kết enzyme được bọc và chuẩn bị với các kháng nguyên đặc hiệu để phát hiện các kháng thể tương ứng. Sự khác biệt với kháng thể đo gián tiếp là thay thế kháng thể enzyme bằng kháng nguyên enzyme. Mẫu vật được kiểm tra trong phương pháp này không cần pha loãng, có thể trực tiếp dùng để xác định, vì vậy độ nhạy cảm của nó tương đối cao hơn phương pháp gián tiếp. Xét nghiệm kháng HBs trong đánh dấu gan B thường áp dụng phương pháp này. Mấu chốt của phương pháp này là chuẩn bị kháng nguyên enzyme, nên căn cứ vào cấu trúc kháng nguyên khác nhau, tìm kiếm phương pháp đánh dấu thích hợp.

3. Kháng thể gián tiếp

Phương pháp gián tiếp là phương pháp thường dùng để kiểm tra kháng thể. Nguyên tắc là sử dụng kháng thể được dán nhãn enzyme (kháng thể globulin miễn dịch chống người) để phát hiện kháng thể được kiểm tra liên kết với kháng nguyên pha rắn, do đó được gọi là phương pháp gián tiếp (xem Hình 2-3). Các bước hoạt động như sau:

1) Liên kết kháng nguyên đặc hiệu với chất mang pha rắn để tạo thành kháng nguyên pha rắn. Rửa để loại bỏ các kháng nguyên và tạp chất không liên kết.

2) Với huyết thanh được kiểm tra pha loãng, phản ứng giữ ấm. Các kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên pha rắn để tạo thành phức hợp kháng nguyên pha rắn. Sau khi rửa, chỉ còn lại kháng thể đặc hiệu trên chất mang pha rắn và các thành phần khác của huyết thanh được rửa sạch trong quá trình rửa.

3) Kháng thể kháng enzyme. Có thể dùng kháng thể Ig để phát hiện tổng số kháng thể, nhưng thường dùng IgG để phát hiện kháng thể IgG. Các kháng thể trong phức hợp miễn dịch pha rắn liên kết với kháng thể kháng thể nhãn enzyme, do đó gián tiếp dán nhãn enzyme. Sau khi rửa, lượng enzyme trên chất mang pha rắn tương quan tích cực với lượng kháng thể được kiểm tra trong mẫu vật.

4) Kết xuất màu nền Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phát hiện kháng thể mầm bệnh và chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

Ưu điểm của phương pháp gián tiếp là phương pháp phát hiện kháng thể tương ứng có thể được thiết lập bằng cách sử dụng cùng một kháng thể tiêu chuẩn enzyme miễn là gói bị biến đổi. Chìa khóa thành công của phương pháp gián tiếp nằm ở độ tinh khiết của kháng nguyên. Mặc dù đôi khi có thể đạt được kết quả thực tế hiệu quả với các gói kháng nguyên thô, nhưng cần được tinh chế càng nhiều càng tốt để tăng tính đặc hiệu của thử nghiệm. Cần đặc biệt chú ý đến việc loại bỏ các tạp chất có thể phản ứng với huyết thanh của người khỏe mạnh nói chung, chẳng hạn như kháng nguyên tái tổ hợp với E. Coli là enzyme được thiết kế, trong đó có thành phần E. Coli, có khả năng phản ứng với kháng thể chống E. Coli trong máu của những người bị nhiễm E. Coli. Kháng nguyên cũng không thể chứa các chất phản ứng với enzyme anti-Ig của con người, chẳng hạn như kháng nguyên từ huyết tương của con người hoặc các mô của con người, nếu Ig không được loại bỏ, và phản ứng dương tính giả cũng xảy ra trong thử nghiệm. Ngoài ra, nếu trong kháng nguyên có protein không liên quan, cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của gói. Một yếu tố gây nhiễu khác trong phương pháp gián tiếp là nồng độ không đặc hiệu cao có trong huyết thanh bình thường. IgG đặc hiệu được kiểm tra trong huyết thanh của bệnh nhân chỉ chiếm một phần nhỏ trong tổng số IgG. IgG rất hấp phụ và IgG không đặc hiệu có thể được hấp phụ trực tiếp vào chất mang pha rắn và đôi khi trên bề mặt của kháng nguyên gói. Do đó, trong phương pháp gián tiếp, các gói kháng nguyên thường được bọc lại một lần nữa với các protein không liên quan (ví dụ như protein huyết thanh bò) để đóng khoảng trống trên pha rắn (blocking). Ngoài ra, mẫu vật phải được pha loãng trước trong quá trình thử nghiệm (1:40~1:200) để tránh tiêu cực quá mức ảnh hưởng đến kết quả.

4. Đo kháng thể cạnh tranh

Khi các chất gây nhiễu trong vật liệu kháng nguyên không dễ loại bỏ hoặc không dễ dàng có đủ kháng nguyên tinh khiết, phương pháp này có thể được sử dụng để phát hiện các kháng thể đặc hiệu. Nguyên tắc là các kháng thể trong mẫu vật và một lượng kháng thể nhãn enzyme nhất định cạnh tranh để liên kết với kháng nguyên pha rắn. Số lượng kháng thể trong mẫu vật càng nhiều, kháng thể nhãn enzyme càng ít liên kết với pha rắn, do đó phản ứng dương tính có màu nhạt hơn phản ứng âm tính. Nếu chống nguyên chất có độ tinh khiết cao, bạn có thể trực tiếp gói bị cố định. Nếu kháng nguyên sẽ có chất gây nhiễu, gói trực tiếp không dễ dàng thành công, có thể áp dụng phương pháp gói bắt, tức là trước tiên gói được gói với kháng nguyên pha rắn tương ứng với kháng thể, sau đó thêm kháng nguyên, hình thành kháng nguyên pha rắn. Tẩy rửa loại bỏ các tạp chất trong kháng nguyên, sau đó thêm vào mẫu vật và kháng thể enzyme để tiến hành phản ứng liên kết cạnh tranh. Các kháng thể cạnh tranh có nhiều mô hình, có thể kết hợp các kháng thể tiêu chuẩn và enzyme với kháng nguyên pha rắn, thường được sử dụng bởi ELISA chống HBc. Một mô hình khác là đưa mẫu vật cùng với kháng nguyên vào kháng thể pha rắn để cạnh tranh liên kết, sau khi rửa lại thêm kháng thể enzyme, phản ứng với kháng nguyên liên kết trên pha rắn. Xét nghiệm kháng HBE thường áp dụng phương pháp này.

5. Đo kháng nguyên theo phương pháp cạnh tranh

Kháng nguyên phân tử nhỏ hoặc nguyên nhân bán kháng thiếu hơn hai vị trí có thể được sử dụng làm phương pháp kẹp, do đó không thể được xác định bằng phương pháp kẹp đôi kháng thể, có thể áp dụng phương pháp cạnh tranh. Nguyên tắc là sự cạnh tranh giữa kháng nguyên trong mẫu vật và một lượng kháng nguyên enzyme nhất định để liên kết với kháng thể pha rắn. Lượng kháng nguyên trong mẫu vật càng nhiều, kháng nguyên nhãn enzyme kết hợp với pha rắn càng ít, màu sắc sau zui càng nhạt. Các xét nghiệm ELISA như hormone phân tử nhỏ, thuốc được sử dụng nhiều hơn.

6. Bắt gói được đo bằng kháng thể pháp lý

Xét nghiệm kháng thể IgM được sử dụng trong chẩn đoán sớm các bệnh truyền nhiễm. Phương pháp gián tiếp ELISA thường chỉ được sử dụng để phát hiện kháng thể tổng số hoặc kháng thể IgG. Nếu các kháng thể IgM được xác định trực tiếp bằng phương pháp gián tiếp của gói kháng nguyên, vì nồng độ kháng thể IgG cao hơn thường tồn tại trong mẫu vật, sau đó sẽ cạnh tranh để liên kết với kháng nguyên pha rắn và làm cho một số kháng thể IgM không thể liên kết với pha rắn. Do đó, để xác định gián tiếp kháng thể IgM với IgM kháng người, trước tiên mẫu vật phải được xử lý bằng protein A hoặc kháng thể kháng IgG để loại bỏ sự can thiệp của IgG. Khi xác định kháng thể IgM trong thử nghiệm lâm sàng, sử dụng phương pháp chụp gói. Giai đoạn đầu tiên được củng cố với gói kháng thể IgM chống lại con người để bắt IgM trong mẫu huyết thanh (bao gồm kháng thể IgM cụ thể chống lại kháng nguyên và IgM không cụ thể). Kháng nguyên sau đó được thêm vào, chỉ liên kết với IgM cụ thể. Sau đó, enzyme được thêm vào để đánh dấu các kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên. Lại có tác dụng với chất nền, màu sắc có liên quan tích cực đến IgM trong mẫu vật. Phương pháp này thường được sử dụng để chẩn đoán sớm nhiễm virus. Xem Hình 2-7 để biết mô hình phát hiện kháng thể đối với virus viêm gan A (HAV). Yếu tố dạng thấp (RF) cũng có thể can thiệp vào việc xác định kháng thể IgM bằng cách chụp gói, dẫn đến phản ứng dương tính giả. Do đó, phương pháp gián tiếp trung hòa IgG gần đây đã được ưa chuộng, và việc sử dụng các loại thuốc thử này để phát hiện kháng thể IgGM chống CMV và IgM chống Toxoplasma gondii đã thành công.

7. Luật ABS-ELISA

ABS là viết tắt của Avidin Biotin System. Affine là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 60.000 và mỗi phân tử bao gồm 4 tiểu đơn vị liên kết năng lượng và biotin. Biotin là các hợp chất phân tử nhỏ, trọng lượng phân tử 244. Các dẫn xuất hydroxysuccinamide được làm bằng phương pháp hóa học có thể tạo thành các sản phẩm đánh dấu biotin với nhiều loại phân tử lớn nhỏ như protein và đường, và phương pháp đánh dấu khá đơn giản. Sự kết hợp của biotin với ái lực rất đặc hiệu, có ái lực lớn hơn nhiều so với kháng thể kháng nguyên và cả hai đều cực kỳ ổn định khi kết hợp. Vì một ái lực có thể liên kết với 4 phân tử biotin, phương pháp ABS và ELISA có thể được chia thành hai loại: ái lực đánh dấu enzyme-biotin (LAB) và ái lực cầu nối-biotin (ABC). Cả hai đều thay thế kháng thể nhãn enzyme (kháng nguyên) trong hệ thống ELISA ban đầu bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) được đánh dấu bằng biotin. Trong LAB, biotin pha rắn phản ứng đầu tiên với ái lực không được đánh dấu và sau đó biotin được đánh dấu bằng enzyme để tăng độ nhạy hơn nữa. Trong những ngày đầu, ái lực được chiết xuất từ lòng trắng trứng, ái lực trứng này là glycoprotein cơ bản và có khả năng hấp phụ mạnh mẽ với các chất mang polystyrene, được sử dụng trong ELISA để tăng cơ sở. Streptomycin chiết xuất từ Streptomyces không có nhược điểm này và có xu hướng thay thế trong các ứng dụng ELISA. Do ABS-ELISA sử dụng nhiều hơn hai tác nhân so với ELISA thông thường, các bước hoạt động được tăng lên, ABS-ELISA không được sử dụng nhiều trong các thử nghiệm lâm sàng.