Tiết kiệm thời gian Cystinase 9 (Caspase9)

Tiết kiệm thời gian Cystinase 9 (Caspase9) Bộ dụng cụ con người
Giới thiệu
Cystinase 9 (Caspase9) là một enzyme được mã hóa bởi gen CASP9. Nó là một caspase khởi động rất quan trọng đối với con đường apoptosis được tìm thấy trong nhiều mô. Các loài tương đồng của nó đã được tìm thấy ở tất cả các động vật có vú được biết đến như Musculus và Pan troglodytes. Caspase-9 thuộc họ caspase và là aspartate protease liên quan đến apoptosis và tín hiệu cytokine. Tín hiệu apoptosis giải phóng và kích hoạt apaf-1 (apoptosome) từ ty thể, sau đó phân tách proenzyme của caspase-9 thành dạng dimer hoạt động. Sự điều hòa của enzyme này xảy ra thông qua phosphoryl hóa các chất ức chế dị sinh, ức chế dimer hóa và gây ra những thay đổi về hình dạng. Xét nghiệm miễn dịch Caspase9 của con người trong bộ dụng cụ này là ELISA kẹp pha rắn ba bước được sử dụng để đo Caspase9 của con người trong dịch thượng lưu, huyết thanh và huyết tương nuôi cấy tế bào. Bộ dụng cụ chứa E. coli biểu hiện Caspase9 ở người tái tổ hợp và kháng thể được sản xuất chống lại protein tái tổ hợp. Kết quả thu được bằng cách sử dụng Caspase9 người tự nhiên cho thấy một đường cong tuyến tính song song với đường cong tiêu chuẩn thu được bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn tái tổ hợp. Những kết quả này cho thấy bộ dụng cụ có thể được sử dụng để xác định giá trị khối lượng tương đối của Caspase9 ở người tự nhiên.

Nguyên tắc phát hiện

Bộ dụng cụ sử dụng phương pháp kẹp kháng thể képKỹ thuật ELISA: Gói kháng thể bắt được sẽ được đưa lên bảng tiêu chuẩn, mẫu được chụp và vật được thử nghiệm trong sản phẩm tiêu chuẩn Caspase9, sau khi ủ, thêm kháng thể thử nghiệm được đánh dấu để làm sạch sau khi ủ, hình thành phức hợp miễn dịch "bắt kháng thể - kháng nguyên - phát hiện kháng thể", sau đó thêm vào liên kết streptomycin peroxidase horseradin để ủ, để làm sạch sau khi ủ, sau đó thêm dung dịch màu TMB, nếu chất được thử nghiệm trong mẫu có màu xanh, thì thêm dung dịch chấm dứt để ngừng phản ứng. Các thành phần tự do trong quá trình phát hiện đều được rửa sạch, giá trị OD được đo ở 450nm bằng máy đo enzyme, tỷ lệ thuận với độ sâu của màu sắc và hàm lượng của vật được đo trong mẫu, nồng độ Caspase9 trong mẫu được tính bằng cách vẽ đường cong tiêu chuẩn.

Điểm hoạt động

1. Khi trộn dung dịch protein, bạn nên luôn tránh phồng rộp. Để tránh ô nhiễm chéo, đầu súng pipet nên được thay thế khi thêm từng sản phẩm tiêu chuẩn, mẫu và thuốc thử. Ngoài ra, mỗi tác nhân nên sử dụng thùng chứa riêng lẻ.

2. Đảm bảo rằng thuốc thử được thêm vào lỗ tấm mà không bị gián đoạn. Để đảm bảo kết quả chính xác, màng niêm phong tốt cần được dán trong các bước ủ.

3. Khi sử dụng máy giặt tấm tự động, thêm thời gian ngâm 30 giây sau khi thêm đệm giặt, hoặc xoay tấm 180 độ giữa các bước giặt, có thể cải thiện độ chính xác của xác định.

4. Chất kết xuất màu nên được giữ không màu cho đến khi thêm vào bảng. Đảm bảo chất tạo màu không bị ánh sáng chiếu vào. Chất tạo màu nên thay đổi từ không màu sang màu xanh.

5. Chấm dứt nên được thêm vào bảng theo thứ tự tương tự như chất tạo màu. Sau khi chấm dứt được thêm vào, màu sắc hình thành trong lỗ sẽ thay đổi từ màu xanh sang màu vàng. Các lỗ màu xanh lá cây cho thấy terminator không được trộn lẫn đầy đủ với dung dịch ma trận.

Các vật liệu khác cần thiết

1. Máy đo enzyme, chứa bước sóng xác định 450nm, trong khi chứa bước sóng hiệu chỉnh 600-680nm tốt hơn;

2- Bộ di dịch và đầu súng;

3. Nước cất hoặc nước khử ion;

4. Hộp mực quy mô 100-1000 mL;

5. Máy rửa chai, xả súng hoặc máy làm sạch tấm micropore tự động;

6. Bộ dao động tấm micropore theo dõi ngang, có khả năng duy trì tốc độ 500 ± 50 vòng/phút;

7. Ống để pha loãng các sản phẩm tiêu chuẩn và mẫu.

Tiết kiệm thời gian Name9 (Caspase9) Bộ dụng cụ con người
Lưu ý

1. Chất chấm dứt được cung cấp bởi bộ dụng cụ này là dung dịch axit sulfuric loãng, có tính ăn mòn nhất định và nên được vận hành thận trọng.

2. Một số thành phần trong bộ dụng cụ này có chứa chất bảo quản có thể gây ra phản ứng dị ứng da và nên đeo mặt nạ để tránh hít phải sương mù.

3. Chất tạo màu B có thể gây kích ứng da, mắt và đường hô hấp. Nên đeo mặt nạ để tránh hít phải sương mù.

4. Đeo găng tay bảo vệ, mắt và mặt hàng bảo vệ, rửa tay sau khi xử lý.

Chuẩn bị thuốc thử

1. Đặt tất cả các thuốc thử ở nhiệt độ phòng cân bằng trong khoảng 30 phút trước khi sử dụng.

2. Cấu hình dung dịch rửa/dung dịch pha loãng: Nếu dung dịch rửa/dung dịch pha loãng (20 ×) có kết tủa tinh thể, cần phải làm nóng 💐 tinh thể hòa tan hoàn toàn ở 37 ℃. Pha loãng với nước cất 1:20 (ví dụ: 1 mL dung dịch rửa cô đặc thêm 19 mL nước cất)

Cấu hình sản phẩm tiêu chuẩn

Lấy các sản phẩm tiêu chuẩn ra khỏi bộ dụng cụ, sẵn sàng.7 ống nghiệm, bắt đầu từ400ng / mlchuẩn cmnr (200 μL) hấp thụ một lượng nhất định theo yêu cầu pha loãng từ 1 × dung dịch pha loãng đến 20 ng/mL (ví dụ: 50 μL dung dịch mẹ tiêu chuẩn+950 μL dung dịch pha loãng 1 × để chuẩn bị 1000 μL dung dịch tiêu chuẩn nồng độ 20 ng/mL), sau đó thêm 500 μL dung dịch pha loãng 1 × vào 6 ống, trong 6 ống riêng biệt pha loãng gấp 2 lần dung dịch tiêu chuẩn 20mg/mL đến 6 gradient, tổng cộng 7 sản phẩm tiêu chuẩn nồng độ, lần lượt là Không.20%/ml、10%/ml、5%/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml，Hấp thụ từ dung dịch tiêu chuẩn nồng độTiêu chuẩn 500μL vào ống tiếp theo, thổi nhẹ và trộn đều, v.v. để pha loãng tỷ lệ lần của sản phẩm tiêu chuẩn (như hình), dung dịch pha loãng 1 × được sử dụng làm tiêu chuẩn nồng độ 0 (0ng/mL)

Tính toán kết quả

Tính trung bình của hàng tiêu chuẩn và mẫuGiá trị ODvà trừ đi giá trị ODcủa lỗ trống là giá trị dương của trường. Lấy nồng độ làm tọa độ ngang và giá trị ODM làm tọa độ dọc, vẽ đường cong chuẩn của hàm logic bốn tham số trên giấy tọa độ (loại bỏ giá trị của nhóm trống khi vẽ) hoặc sử dụng phần mềm máy tính có thể tạo ra sự phù hợp của đường cong logic bốn tham số (4-P) để tạo đường cong chuẩn. Nếu giá trị OD của mẫu cao hơn giới hạn trên của đường cong tiêu chuẩn, cần pha loãng lại và nhân với bội số pha loãng tương ứng khi tính nồng độ mẫu.。

Dữ liệu mẫu

Dữ liệu và đường cong sau đây chỉ để tham khảo, người thí nghiệm cần thiết lập đường cong tiêu chuẩn dựa trên dữ liệu thí nghiệm của mình.

Các đường cong tiêu chuẩn được hiển thị trong sơ đồ này chỉ là ví dụ và kết quả tính toán phải được tính toán gần như là kết quả mẫu với các đường cong tiêu chuẩn được vẽ bởi các sản phẩm tiêu chuẩn cùng thử nghiệm
Độ nhạy

Sau khi thử nghiệm mẫu, độ nhạy phát hiện của bộ dụng cụ này là0,16 ng / ml.

Đặc trưng

Bộ dụng cụ xác định xác định người tự nhiên và tái tổ hợpCaspase9。

Các protein liên quan khác được chuẩn bị trong một bộ đệm pha loãng như50ng/mL， Và xác định tính phản ứng chéo. Không có phản ứng chéo rõ ràng nào được quan sát thấy.

Tóm tắt các bước thử nghiệm
1. Thêm các sản phẩm tiêu chuẩn và mẫu, phản ứng tránh ánh sáng 37 ℃ 1,5h, rửa 3 lần.

2. Kiểm tra kháng thể.Phản ứng tránh ánh sáng 37 độ C 1 giờ, rửa 4 lần.

3. liên kết enzyme,Phản ứng tránh ánh sáng 37 độ C 30 phút, rửa 4 lần.

4. Thêm chất lỏng màu, phản ứng tránh ánh sáng 37 độ C trong 15 phút.

5. Với terminator, đọc trong vòng 5 phút

ngườiName9(Caspase9)Bộ dụng cụ để phát hiện định lượng nuôi cấy tế bào thanh lọc, huyết thanh, huyết tương của con ngườiCaspase9Trước khi sử dụng sản phẩm này, bạn phải đọc đầy đủ hướng dẫn sử dụng.NgườiBộ dụng cụ ELISA chỉ dành cho nghiên cứu khoa học và không được sử dụng trong các chẩn đoán khác.。