Dòng tế bào MOC2

Dòng tế bào MOC2

Uppaluri Lab Tissue Culture Protocols cho các dòng tế bào MOCCập nhật 12.12.16

Vật liệu cần thiết (xem giao thức IMDM đính kèm cho thuốc thử cần thiết để tạo ra phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC)

Sigma Aldrich: DMSO: D2650-100ml

FisherScientific:

T150Chai: 07-200-64

T75 chai: 10-126-37

Cryovials: 03-374-059

Bộ lọc 45um: 09-754-21

05% Trypsin: sh30236,01

25% Trypsin: sh30042,01

Dòng Indolent - MOC1, 22

Đường tấn công - MOC2

Dòng tế bào tan lạnh

1. Thêm phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC 21ml vào T150 trước khi tan chảy (hoặc 10ml vào T75 nếu muốn tan chảy thành aT75)

2. Loại bỏ cryovial từ nitơ lỏng, phun lọ với 70% rượu để làm sạch nó.

3. Giữ nửa dưới của freeovial trong 37Cwaterbath (không để nắp chạm vào nước, để tránh ô nhiễm) cho đến khi có một mảnh băng nhỏ còn lại nổi.

4. Phun cryovial một lần nữa với ETOH và đặt trong hood. Pipet 1ml phương tiện truyền thông vào 1ml tế bào và thêm 2ml này vào T150 đã chứa phương tiện truyền thông (để tạo tổng cộng 22ml cho một T150).

5. Lấy một số phương tiện truyền thông đã trong bình T150 và rửa sạch tấm cryovialand này để đảm bảo bạn có tất cả các tế bào còn lại trong cryovial.

Dòng tế bào đông lạnh:

Làm việc nhanh chóng, vì DMSO độc hại cho tế bào

Đối với mỗi lọ T150 với tụ hợp tế bào 70-80%, đông lạnh 3-4 lọ.

1. Các tế bào thu hoạch từ T150 như thấy dưới đây

2. Quay xuống thành viên trong ống hình nón 15ml (1000 RPM x5 phút)

3. Bỏ ra siêu sinh

4. Nhấn ống hình nón 15ml để treo tế bào

5. Thêm 1,5ml phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC, tái tạo tế bào trong phương tiện truyền thông - giữ trên băng

6. Thêm 1,5 ml phương tiện đóng băng chậm rãi trong khi ống trên băng

Để làm cho phương tiện đóng băng - 20% DMSO trong phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC. Ví dụ: Đối với 20ml cổ phiếu - thêm 16ml IMDM MOC dòng phương tiện truyền thông và 4ml DMSO. Bộ lọc tiêm sử dụng bộ lọc.45um

7. Aliquot 1ml mỗi đến 3 cryovials

8. Lưu trữ ở -80C trong không quá 2 tuần.

9. Đặt vào nitơ lỏng trong vòng 1-2 tuần.

Lưu ý: Nếu mong muốn, có thể tăng lên 2ml IMDM và 2ml phương tiện đóng băng để lưu trữ trong 4 lọ. Ngoài ra, ý tưởng tốt là đếm tế bào và ghi lại trên lọ trước khi đóng băng tế bào.

Dòng tế bào MOC2

Đặc điểm dòng tế bào:

Indolent - MOC1: ít hung hăng hơn dựa trên các nghiên cứu in vivo. Nếu vượt qua 1:12 từ 80% tụ T150, mất 2-4 ngày để đạt 80% tụ. Các dòng tế bào MOC1 mất nhiều thời gian hơn để rời khỏi bình khi được thu hoạch so với các dòng tế bào hung hăng hơn.

Aggressive - MOC2: tích cực hơn dựa trên các nghiên cứu in vivo. Nếu vượt qua 1:12 từ 80% hội tụ

T150, mất 2-4 ngày để đạt đến 80% hội tụ. Các dòng tế bào hung hăng thoát khỏi bình dễ dàng hơn nhiều so với các dòng lờ lờ.

Thu hoạch và truyền tế bào từ T150, 80% hội tụ:

1. Đổ phương tiện truyền thông từ T150 vào bình thải

2. Rửa một lần với 10-20ml PBS. Rửa PBS.

3. Thêm 1,5ml trypsin 0,05%, vỏ đầu để đảm bảo trypsin bao phủ toàn bộ diện tích bề mặt và do đó chạm vào tất cả các tế bào (làm điều này nhanh chóng để các tế bào không tiếp xúc với trypsin quá lâu), đổ trypsin ra, sau đó áp dụng lại 1,5ml trypsin 0,25%.

4. Đặt trong lò ủ 37C. Nướng thai trong 3-4 phút cho các dòng tế bào hung hăng và có thể mất đến 10-12 phút để lơ lơ nhưng kiểm tra sau 6-8 phút.

5. Nhấn phía của bình chống lại bàn tay cố ý vài lần để nới lỏng các tế bào

6. Kiểm tra dưới kính hiển vi để xem các tế bào có nổi tự do trong phương tiện truyền thông không. Nếu hầu hết không, hãy đặt lại trong lò nuôi 37C trong thêm 3-5 phút. Cố gắng không để các tế bào ngồi trong trypsin quá lâu vì điều này sẽ giết chết các tế bào.

7. Một khi tất cả hoặc hầu hết các tế bào đang nổi, thêm 10ml phương tiện IMDM MOC dòng để trung lập phản ứng.

8. Pipette phương tiện và tế bào từ bình vào một hình nón 15ml để tế bào viên. Lấy ly tâm ở 1000 RPM x 5 phút.

9. Đổ ra chất vượt trội.

10. Để vượt qua các tế bào ở 1: 12 - tái treo các tế bào trong 12 ml khác của phương tiện truyền thông.

11. Lấy 1ml từ này và đặt trong bình T150 mới với tổng khối lượng 22ml phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC (pha loãng 1: 12)

12. Đặt trở lại trong lò ủ 37C để phát triển. Nên đạt đến 80% hội tụ trong 2-4 ngày.

Tiêm vào cạnh chuột (heterotopic):

Nồng độ tế bào cần thiết:

MOC1, MOC22: (tiêm tế bào 1e6 trong 0,15ml) = 6,66e6 tế bào / ml MOC2: (tiêm tế bào 1e5 trong 0,15ml) = 6,66e5 tế bào / ml

1. thu hoạch tế bào với 0,25% trypsin như đã ghi nhận ở trên.

2. Sau khi trung lập trypsin với phương tiện truyền thông dòng IMDM MOC, quay tế bào xuống thành viên (1000 RPM x5 phút) trong hình nón 50ml. (Lưu ý: sử dụng hình nón 50ml để cho phép kim đo nhỏ vẽ các tế bào cho

tiêm.

3. Rửa tế bào bằng cách treo lại viên tế bào trong 10ml PBS lạnh băng (đảm bảo loại bỏ càng nhiều phương tiện có chứa FCS càng tốt), quay tế bào xuống thành viên một lần nữa (1000 RPM x5 phút)

4. Rửa tế bào một lần nữa bằng cách treo lại viên tế bào trong 3-6 ml PBS lạnh băng (khối lượng được xác định theo kích thước của viên, vì bạn sẽ sử dụng khối lượng này để đếm tế bào)

5. Đếm tế bào sperml bằng cách sử dụng máy đo huyết cầu hoặc đếm tế bào tự động, sử dụng màu xanh trypan để

loại bỏ các tế bào chết. Sử dụng tổng số tế bào hiện diện (tế bào / ml x tổng ml PBS), tính toán khối lượng cần thiết để treo hạt tế bào để đạt được nồng độ 6,66e6 (MOC1, MOC22) hoặc 6,66e5 tế bào / ml (MOC2).

Ví dụ, đối với MOC1, số tế bào là: 2,8e6 tế bào / ml x 5ml (PBS) = tổng số tế bào 14e6. 14e6 tế bào / 6.66e6 tế bào / ml = 2.1ml PBS để treo viên tế bào trong.

6. Quay các tế bào xuống thành viên một lần nữa. Đổ PBS vượt trội (không hấp thụ với ống pipet). Đóng lại viên trong khối lượng tính toán của băng lạnh PBS cần thiết để đạt được thích hợp

nồng độ, lưu ý rằng sẽ có ~ 200ul còn lại trong 50ml hình nón sau khi đổ chất siêu.

7. Chuyển 50ml hình nón vào băng và tiêm 0,15ml (150ul) tế bào cho mỗi con chuột trong sườn dưới da.

8. Tiêm chuột theo giao thức tiêu chuẩn. Chúng tôi sử dụng ống tiêm 1ml. Chúng tôi vẽ các tế bào bằng cách sử dụng kim 21 gauge 1,5 inch và chuyển kim sang kim 26 gauge ½ inch để tiêm.

Giao thức cho phương tiện truyền thông 1L